基因工程细胞与Ⅰ型糖尿病治疗
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国外医学遗传学分册 2000年第23卷第3期
基因工程细胞与Ⅰ型糖尿病治疗
彭永德1，2(综述) 陈家伦2(审校)
摘 要 目前Ⅰ型糖尿病的基因治疗领域取得众多进展，如转入凋亡基因异种胰岛细胞以阻断免疫反应，通过各种策略将内分泌细胞系、肝细胞及成纤维细胞等经基因工程构建成能分泌成熟胰岛素的细胞，其分泌作用需受正常调控，本文对有关进展作以综述。
关键词：基因工程 基因治疗 Ⅰ型糖尿病
Ⅰ型糖尿病由胰岛β细胞自身免疫破坏所致，常规治疗是定期注射胰岛素。然而血糖难以达到功能良好的β细胞自然分泌胰岛素的控制状态，急性并发症(低血糖及酮症酸中毒)偶尔发生，慢性并发症仍为威胁糖尿病患者的主要危险[1]。为建立内源性胰岛素分泌系统，胰腺或胰肾联合移植已做了尝试，但需长期免疫抑制治疗，亦有较高的失败率。从异体分离β细胞移植也存在诸多缺陷，且胰腺供体有限。目前试图替代人β细胞，首先利用异种胰岛或β细胞系；其次是对非胰岛素的细胞必需具有下列特性：①表达GK和Glut2；②低表达高亲和力的已糖激酶(HK)；③表达激素原转换酶PC2、PC3，能有效加工胰岛素原成胰岛素；④能将胰岛素释放到细胞外的分泌系统。然而仅β细胞具有所有这些特性，因而已探索对某些细胞进行改造。
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1 细胞的基因工程构建
1.1异种胰岛细胞
胎猪胰岛移植用于Ⅰ型糖尿病具有较好的疗效且取材便利，然而因排斥显著疗效难以持久[2]。FasL受体表达在免疫细胞表面，Fas-L与Fas受体相互作用可诱导免疫细胞凋亡，故该作用在维持免疫系统稳态及免疫耐受中发挥重要作用。Lau研究显示同时移植经基因工程处理能表达Fas配体(FasL)的肌纤维细胞，可明显延长移植胰岛细胞存活期。但半数以上的小鼠仍在80天内移植物失效，部分由于肌纤维细胞停止表达Fas-L\[3]，如何使Fas-L长期表达尚需进一步研究。
1.2 细胞株构建
β细胞类细胞系显然是一类较符合生理的胰岛替代物，经构建的细胞株可大量获得。在转基因小鼠胰岛细胞中定向表达SV40大T(SV40 large T)抗原可导致胰岛素瘤，已作为细胞株的来源[4]。这引起细胞对葡萄糖刺激的胰岛素反应存在缺陷，表现为反应减弱或过强，可能与葡萄糖感应器：葡萄糖磷酸化酶(GK)和葡萄糖转运体(Glut2)的表达异常有关[5]。同时尽管未免疫隔离的细胞将被免疫系统杀灭，但这种永生型细胞移植于人体需要微包囊化。
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1.3 神经内分泌细胞
早在1983年有人曾对神经内分泌细胞株(一种分泌ACTH细胞株，AtT20)作生物改造，用病毒启动子调控人胰岛素cDNA转录获得初步结果。在胰腺特异性启动子调控下GK基因可在AtT20表达，用表达载体转染后则表现出葡萄糖刺激的胰岛素释放[6]。正常的葡萄糖感应不仅需要表达Glut2，而且需要类似于正常β细胞的GK/HK活性比值[7]。最近有学者将胰岛素原表达载体直接导入NOD小鼠的垂体间叶POMC分泌细胞，能大量分泌成熟胰岛素，而这些细胞不受针对胰岛细胞的自身免疫破坏，将一定量的构建细胞移植于NOD糖尿病小鼠，高血糖及糖尿病症状完全恢复，与胰岛细胞自体移植相比，显示分泌活性更高，再血管化更明显[8]。
1.4 肝细胞
经基因工程构建的外源型细胞株用于Ⅰ型糖尿病存在各种障碍，已促使许多研究着眼于内源性细胞。除胰岛细胞外肝细胞是含有葡萄糖感应器(Glut2及GK)唯一的体细胞，许多肝脏特异性基因受生理性葡萄糖调控，故作为Ⅰ型糖尿病基因治疗的靶细胞尤为引人关注。然而肝细胞不具备有葡萄糖控制胞吐作用的分泌颗粒，也无贮存分泌性蛋白的隔离区。当血糖升高时，不会出现早相胰岛素分泌。肝细胞也不具有切除C肽所需的激素原转化酶(PC2和PC3)，故不能加工胰岛素原分子[9]。因而，针对肝细胞作为分泌胰岛素细胞存在上述缺陷，有关研究不断深入。Valera在磷酸烯醇式丙酮酸羧基酶(PEPCK)基因调控区控制下，得到表达人胰岛素原基因的转基因小鼠，从肝细胞分泌的胰岛素原具有生物活性，该动物呈现血糖正常且健康善良好，经链脲佐菌素(STZ)处理转基因小鼠后，胰岛素mRNA水平较STZ处理的非转基因的对照鼠增加，且血中C肽增加，血糖水平下降达40%[10]。
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此外，肝肿瘤细胞亦可作为胰岛素表达载体转染的候选细胞，Gros等将融合胰岛素基因构建于哺乳细胞的表达载体，其中含有人胰岛素原基因(含有费林蛋白内切酶切点)及PEPCK基因的启动子片段，再转染到大鼠肝肿瘤细胞，后经Northern印迹、免疫组化及HPLC分析显示90%胰岛素原被加工成胰岛素。胰岛素分泌反应快速，经二丙基cAMP+地塞米松诱导15分钟，胰岛素分泌量明显增加，1小时内增加10倍，表现为内源性PEPCK基因表达受抑及葡萄糖摄取增加[11]。若同时将人Glut2基因转染肝肿瘤细胞，胰岛素分泌可受葡萄糖浓度调控[12]。
1.5 成纤维细胞及其它细胞
Taniguchi用人胰岛素原cDNA转染成纤维细胞(LtK细胞)，人胰岛素原分泌量达91ng/24小时/106细胞。这些细胞经半透膜(5%琼脂糖胶)微囊化，体外研究显示2×106微囊化的转染细胞能稳定产生胰岛素原80余天(204.4±5.2ng/ml/天)，若种植于STZ糖尿病小鼠腹腔内，血糖恢复正常达30天[13]。另外，将表达胰岛素原的质粒转染成肌细胞，约50%胰岛素原转化为胰岛素，其分泌功能持续达1个月[14]。Kuzume用胰岛素原基因构建的腺病毒载体转染到293细胞，再植入胰腺全切的狗体内，与定期注射胰岛素组相比，血糖维持正常且生存期明显延长，即使口服15g葡萄糖后血糖仍维持正常[15]。
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2 细胞因子
TGFβ1能降调许多免疫反应，故有学者将表达TGFβ1载体转染NOD小鼠，TGFβ1水平较对照组增加，迟发型超敏反应受抑制能保护具有自身免疫反应倾向的NOD小鼠免于发生胰岛炎或糖尿病，相反转入干扰素γ的NOD小鼠早发糖尿病[16]。此外，血管内皮细胞生长因子(VEGF)与新生血管形成有关，观察显示在糖尿病NOD小鼠的缺血部位VEGF水平下降，以致干扰侧枝循环形成，肌肉注射编码VEGF的腺病毒载体，可使NOD糖尿病小鼠的VEGF的腺病毒载体，可使NOD糖尿病小鼠的VEGF水平及新生血管形成作用恢复正常[17]。
3 表达载体
腺病毒载体较适合体内基因转导，其特点是产生的梯度高，能有效地把基因转导入静止期细胞，遗传信息保持其独立可避免因插入性突变改变细胞基因型的危险。但可激发细胞免疫，甚至可针对导入基因[18]，同时转入基因表达时间有限，故不适宜Ⅰ型糖尿病治疗。缺陷型重组逆转录病毒载体导入细胞后具有自我更新的特性，可长期表达。但产生滴度较低，且细胞需处在增殖期，否则前病毒DNA不易整合到染色体DNA。
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目前正研制新一代组合载体可克服上述不足，该载体是来自不同病毒成份及特性组合体。Woo用逆转录病毒将胰岛素原基因导入大鼠肝脏，在病毒末端长重复序列的调控下，至少5%～15%肝细胞被转染，持续达6个月。若用STZ处理大鼠，6天后均死于酸中毒，而在转导2周后在用STZ处理转基因大鼠，部分大鼠存活长达3周，但血糖水平类似于对对照鼠。提示来自于肝细胞表达的胰岛素原的活性可以防止肝糖原大量减少，脂肪蓄积及酮体产生，但其转染效率尚不能使血糖正常[19]。
4 胰岛素原加工的改进
正常时胰岛素在β细胞分泌颗粒内加工为成熟胰岛素需要激素原转换酶PC2、PC3。但肝细胞不能有效地加工胰岛素原，故产生的胰岛素原的生物活性较胰岛素低。另有一种富含于肝细胞的成对碱性氨基酸蛋白酶(亦称泛转换酶或费林蛋白酶，furin)，仅能识别鼠类胰岛素原的Arg-X-Lys-Arg序列，不能有效加工导入的人胰岛素原。为此，将furin序列引入人胰岛素原cDNA的G-C、C-A结合点，再导入肝细胞即可分泌成熟胰岛素[20]。因而，有学者将含有furin识别序列的人胰岛素原载体转基因到小鼠肝脏，经高效液相色谱(HPLC)分析显示胰岛素原能有效地加工成胰岛素分子[21]。
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5 转化效率
首先，Page通过改进培养条件或加入肝细胞生长因子(HGF)能使80%小鼠肝细胞及40%人肝细胞被转导[22]。其次，亦可改进载体本身，一种组合病毒颗粒含有慢病毒(lentivirus,HIV1)可将前病毒基因组整合到非分裂期细胞内，高滴度制备逆转录病毒载体，利用VSV包被蛋白作为病毒壳蛋白替代Env基因产物，可转导静止期肝细胞β，极有可能成为Ⅰ型糖尿病基因治疗的载体。
6 结语
综上所述，要取代Ⅰ型糖尿病的注射胰岛素治疗，移植能分泌具有生物活性胰岛素的细胞将是未来主要方向。然而，对细胞作基因工程以建立一种新型“β细胞”较为复杂，要作为临床治疗手段，尚需进行许多改进得到更多的临床验证，此外，用细胞因子预防Ⅰ型糖尿病或血管并发症的临床价值尚待探索。在此崭新领域内治疗糖尿病可靠方法能否脱颖而出，取决其疗效、安全、方便及费用。
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作者简介：彭永德，男，1961年生，博士研究生，副教授
作者单位：1，上海第二医科大学瑞金医院上海市内分泌研究所 上海，200025；
2，国家人类基因组南方研究中心，上海 201203
参考文献
[1] The Diabetes Control,Complications Trial Research Group.N Eng J Med,1993;329:977-986.
[2] Groth CG,et al.Lancet,1994;344:1402-1404.
[3] Lau HT et al.Science,1996;273:109-112.
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[4] Miyazaki J et al.Endocrinology,1990;127:126-132.
[5] Ferber S et al.J Biol Chem,1994;269:11523-11529.
[6] Newgard CB. Diabetes,1994;43:341-350.
[7] Hughes SD et al.Proc Natl Acad Sci USA,1992;89:688-692.
[8] Lipes MA et al.Acta Diabetol,1997;34(1):2-5.
[9] Vollenweider F.J Biol Chem,1992;267:14629-14636.
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[10] Valera A et al.FASEB J,1994;8:440-447.
[11] Gros L.Hum Gene Ther,1997;8(18):2249-2259.
[12] Simpson AM et al.Gene Ther,1997;4(11):1202-1215.
[13] Taniguchi H et al.J Surg Res,1997;70:41-45.
[14] Simonson GD et al.Hum Gene Ther,1996;7(1):71-78.
[15] Kuzme M et al.Transplant Proc,1998;30(7):3416.
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[16] Piccirillo CA et al.J Immunol,1998;161(8):3950-3956.
[17] Rivard A et al.Am J Pathol,1999;154(2):355-363.
[18] Tripathy SK et al.Nat Med,1996;2:5545-5550.
[19] Kolodka TM et al.Proc Natl Acad Sci USA ,1995;92:3293-3297.
[20] Groskreutz DJ et al.J Biol Chem,1994;269:6241-6246.
[21] Mitanchez D et al.FEBS Lett,1998;421(3):285-289.
[22] Pages JC et al.Hum Gen Ther,1995;6:21-30., 百拇医药
彭永德1，2(综述) 陈家伦2(审校)
摘 要 目前Ⅰ型糖尿病的基因治疗领域取得众多进展，如转入凋亡基因异种胰岛细胞以阻断免疫反应，通过各种策略将内分泌细胞系、肝细胞及成纤维细胞等经基因工程构建成能分泌成熟胰岛素的细胞，其分泌作用需受正常调控，本文对有关进展作以综述。
关键词：基因工程 基因治疗 Ⅰ型糖尿病
Ⅰ型糖尿病由胰岛β细胞自身免疫破坏所致，常规治疗是定期注射胰岛素。然而血糖难以达到功能良好的β细胞自然分泌胰岛素的控制状态，急性并发症(低血糖及酮症酸中毒)偶尔发生，慢性并发症仍为威胁糖尿病患者的主要危险[1]。为建立内源性胰岛素分泌系统，胰腺或胰肾联合移植已做了尝试，但需长期免疫抑制治疗，亦有较高的失败率。从异体分离β细胞移植也存在诸多缺陷，且胰腺供体有限。目前试图替代人β细胞，首先利用异种胰岛或β细胞系；其次是对非胰岛素的细胞必需具有下列特性：①表达GK和Glut2；②低表达高亲和力的已糖激酶(HK)；③表达激素原转换酶PC2、PC3，能有效加工胰岛素原成胰岛素；④能将胰岛素释放到细胞外的分泌系统。然而仅β细胞具有所有这些特性，因而已探索对某些细胞进行改造。
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1 细胞的基因工程构建
1.1异种胰岛细胞
胎猪胰岛移植用于Ⅰ型糖尿病具有较好的疗效且取材便利，然而因排斥显著疗效难以持久[2]。FasL受体表达在免疫细胞表面，Fas-L与Fas受体相互作用可诱导免疫细胞凋亡，故该作用在维持免疫系统稳态及免疫耐受中发挥重要作用。Lau研究显示同时移植经基因工程处理能表达Fas配体(FasL)的肌纤维细胞，可明显延长移植胰岛细胞存活期。但半数以上的小鼠仍在80天内移植物失效，部分由于肌纤维细胞停止表达Fas-L\[3]，如何使Fas-L长期表达尚需进一步研究。
1.2 细胞株构建
β细胞类细胞系显然是一类较符合生理的胰岛替代物，经构建的细胞株可大量获得。在转基因小鼠胰岛细胞中定向表达SV40大T(SV40 large T)抗原可导致胰岛素瘤，已作为细胞株的来源[4]。这引起细胞对葡萄糖刺激的胰岛素反应存在缺陷，表现为反应减弱或过强，可能与葡萄糖感应器：葡萄糖磷酸化酶(GK)和葡萄糖转运体(Glut2)的表达异常有关[5]。同时尽管未免疫隔离的细胞将被免疫系统杀灭，但这种永生型细胞移植于人体需要微包囊化。
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1.3 神经内分泌细胞
早在1983年有人曾对神经内分泌细胞株(一种分泌ACTH细胞株，AtT20)作生物改造，用病毒启动子调控人胰岛素cDNA转录获得初步结果。在胰腺特异性启动子调控下GK基因可在AtT20表达，用表达载体转染后则表现出葡萄糖刺激的胰岛素释放[6]。正常的葡萄糖感应不仅需要表达Glut2，而且需要类似于正常β细胞的GK/HK活性比值[7]。最近有学者将胰岛素原表达载体直接导入NOD小鼠的垂体间叶POMC分泌细胞，能大量分泌成熟胰岛素，而这些细胞不受针对胰岛细胞的自身免疫破坏，将一定量的构建细胞移植于NOD糖尿病小鼠，高血糖及糖尿病症状完全恢复，与胰岛细胞自体移植相比，显示分泌活性更高，再血管化更明显[8]。
1.4 肝细胞
经基因工程构建的外源型细胞株用于Ⅰ型糖尿病存在各种障碍，已促使许多研究着眼于内源性细胞。除胰岛细胞外肝细胞是含有葡萄糖感应器(Glut2及GK)唯一的体细胞，许多肝脏特异性基因受生理性葡萄糖调控，故作为Ⅰ型糖尿病基因治疗的靶细胞尤为引人关注。然而肝细胞不具备有葡萄糖控制胞吐作用的分泌颗粒，也无贮存分泌性蛋白的隔离区。当血糖升高时，不会出现早相胰岛素分泌。肝细胞也不具有切除C肽所需的激素原转化酶(PC2和PC3)，故不能加工胰岛素原分子[9]。因而，针对肝细胞作为分泌胰岛素细胞存在上述缺陷，有关研究不断深入。Valera在磷酸烯醇式丙酮酸羧基酶(PEPCK)基因调控区控制下，得到表达人胰岛素原基因的转基因小鼠，从肝细胞分泌的胰岛素原具有生物活性，该动物呈现血糖正常且健康善良好，经链脲佐菌素(STZ)处理转基因小鼠后，胰岛素mRNA水平较STZ处理的非转基因的对照鼠增加，且血中C肽增加，血糖水平下降达40%[10]。
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此外，肝肿瘤细胞亦可作为胰岛素表达载体转染的候选细胞，Gros等将融合胰岛素基因构建于哺乳细胞的表达载体，其中含有人胰岛素原基因(含有费林蛋白内切酶切点)及PEPCK基因的启动子片段，再转染到大鼠肝肿瘤细胞，后经Northern印迹、免疫组化及HPLC分析显示90%胰岛素原被加工成胰岛素。胰岛素分泌反应快速，经二丙基cAMP+地塞米松诱导15分钟，胰岛素分泌量明显增加，1小时内增加10倍，表现为内源性PEPCK基因表达受抑及葡萄糖摄取增加[11]。若同时将人Glut2基因转染肝肿瘤细胞，胰岛素分泌可受葡萄糖浓度调控[12]。
1.5 成纤维细胞及其它细胞
Taniguchi用人胰岛素原cDNA转染成纤维细胞(LtK细胞)，人胰岛素原分泌量达91ng/24小时/106细胞。这些细胞经半透膜(5%琼脂糖胶)微囊化，体外研究显示2×106微囊化的转染细胞能稳定产生胰岛素原80余天(204.4±5.2ng/ml/天)，若种植于STZ糖尿病小鼠腹腔内，血糖恢复正常达30天[13]。另外，将表达胰岛素原的质粒转染成肌细胞，约50%胰岛素原转化为胰岛素，其分泌功能持续达1个月[14]。Kuzume用胰岛素原基因构建的腺病毒载体转染到293细胞，再植入胰腺全切的狗体内，与定期注射胰岛素组相比，血糖维持正常且生存期明显延长，即使口服15g葡萄糖后血糖仍维持正常[15]。
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2 细胞因子
TGFβ1能降调许多免疫反应，故有学者将表达TGFβ1载体转染NOD小鼠，TGFβ1水平较对照组增加，迟发型超敏反应受抑制能保护具有自身免疫反应倾向的NOD小鼠免于发生胰岛炎或糖尿病，相反转入干扰素γ的NOD小鼠早发糖尿病[16]。此外，血管内皮细胞生长因子(VEGF)与新生血管形成有关，观察显示在糖尿病NOD小鼠的缺血部位VEGF水平下降，以致干扰侧枝循环形成，肌肉注射编码VEGF的腺病毒载体，可使NOD糖尿病小鼠的VEGF的腺病毒载体，可使NOD糖尿病小鼠的VEGF水平及新生血管形成作用恢复正常[17]。
3 表达载体
腺病毒载体较适合体内基因转导，其特点是产生的梯度高，能有效地把基因转导入静止期细胞，遗传信息保持其独立可避免因插入性突变改变细胞基因型的危险。但可激发细胞免疫，甚至可针对导入基因[18]，同时转入基因表达时间有限，故不适宜Ⅰ型糖尿病治疗。缺陷型重组逆转录病毒载体导入细胞后具有自我更新的特性，可长期表达。但产生滴度较低，且细胞需处在增殖期，否则前病毒DNA不易整合到染色体DNA。
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目前正研制新一代组合载体可克服上述不足，该载体是来自不同病毒成份及特性组合体。Woo用逆转录病毒将胰岛素原基因导入大鼠肝脏，在病毒末端长重复序列的调控下，至少5%～15%肝细胞被转染，持续达6个月。若用STZ处理大鼠，6天后均死于酸中毒，而在转导2周后在用STZ处理转基因大鼠，部分大鼠存活长达3周，但血糖水平类似于对对照鼠。提示来自于肝细胞表达的胰岛素原的活性可以防止肝糖原大量减少，脂肪蓄积及酮体产生，但其转染效率尚不能使血糖正常[19]。
4 胰岛素原加工的改进
正常时胰岛素在β细胞分泌颗粒内加工为成熟胰岛素需要激素原转换酶PC2、PC3。但肝细胞不能有效地加工胰岛素原，故产生的胰岛素原的生物活性较胰岛素低。另有一种富含于肝细胞的成对碱性氨基酸蛋白酶(亦称泛转换酶或费林蛋白酶，furin)，仅能识别鼠类胰岛素原的Arg-X-Lys-Arg序列，不能有效加工导入的人胰岛素原。为此，将furin序列引入人胰岛素原cDNA的G-C、C-A结合点，再导入肝细胞即可分泌成熟胰岛素[20]。因而，有学者将含有furin识别序列的人胰岛素原载体转基因到小鼠肝脏，经高效液相色谱(HPLC)分析显示胰岛素原能有效地加工成胰岛素分子[21]。
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首先，Page通过改进培养条件或加入肝细胞生长因子(HGF)能使80%小鼠肝细胞及40%人肝细胞被转导[22]。其次，亦可改进载体本身，一种组合病毒颗粒含有慢病毒(lentivirus,HIV1)可将前病毒基因组整合到非分裂期细胞内，高滴度制备逆转录病毒载体，利用VSV包被蛋白作为病毒壳蛋白替代Env基因产物，可转导静止期肝细胞β，极有可能成为Ⅰ型糖尿病基因治疗的载体。
6 结语
综上所述，要取代Ⅰ型糖尿病的注射胰岛素治疗，移植能分泌具有生物活性胰岛素的细胞将是未来主要方向。然而，对细胞作基因工程以建立一种新型“β细胞”较为复杂，要作为临床治疗手段，尚需进行许多改进得到更多的临床验证，此外，用细胞因子预防Ⅰ型糖尿病或血管并发症的临床价值尚待探索。在此崭新领域内治疗糖尿病可靠方法能否脱颖而出，取决其疗效、安全、方便及费用。
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作者单位：1，上海第二医科大学瑞金医院上海市内分泌研究所 上海，200025；
2，国家人类基因组南方研究中心，上海 201203
参考文献
[1] The Diabetes Control,Complications Trial Research Group.N Eng J Med,1993;329:977-986.
[2] Groth CG,et al.Lancet,1994;344:1402-1404.
[3] Lau HT et al.Science,1996;273:109-112.
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[4] Miyazaki J et al.Endocrinology,1990;127:126-132.
[5] Ferber S et al.J Biol Chem,1994;269:11523-11529.
[6] Newgard CB. Diabetes,1994;43:341-350.
[7] Hughes SD et al.Proc Natl Acad Sci USA,1992;89:688-692.
[8] Lipes MA et al.Acta Diabetol,1997;34(1):2-5.
[9] Vollenweider F.J Biol Chem,1992;267:14629-14636.
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[10] Valera A et al.FASEB J,1994;8:440-447.
[11] Gros L.Hum Gene Ther,1997;8(18):2249-2259.
[12] Simpson AM et al.Gene Ther,1997;4(11):1202-1215.
[13] Taniguchi H et al.J Surg Res,1997;70:41-45.
[14] Simonson GD et al.Hum Gene Ther,1996;7(1):71-78.
[15] Kuzme M et al.Transplant Proc,1998;30(7):3416.
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[16] Piccirillo CA et al.J Immunol,1998;161(8):3950-3956.
[17] Rivard A et al.Am J Pathol,1999;154(2):355-363.
[18] Tripathy SK et al.Nat Med,1996;2:5545-5550.
[19] Kolodka TM et al.Proc Natl Acad Sci USA ,1995;92:3293-3297.
[20] Groskreutz DJ et al.J Biol Chem,1994;269:6241-6246.
[21] Mitanchez D et al.FEBS Lett,1998;421(3):285-289.
[22] Pages JC et al.Hum Gen Ther,1995;6:21-30., 百拇医药